人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠深静脉血栓

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文题释义：

脐带间充质干细胞：人脐带间充质干细胞是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我增殖及多向分化、免疫调节、归巢、旁分泌、组织修复及促血管新生等特性，严格意义上其来源分4种，即华通氏胶、脐血、脐血管及脐血管周围细胞，实验采用脐带华通氏胶源性间充质干细胞。

血栓溶解、机化及再通：在血栓形成后，纤维蛋白溶解酶激活以及血栓内白细胞释放溶蛋白酶，较小的血栓可以被完全溶解吸收，若血栓较大或纤维蛋白溶解酶活性不足，存留的血栓则发生机化及再通。内皮细胞、成纤维细胞和炎性细胞从血管壁长入血栓，由肉芽组织逐渐取代血栓的过程，为血栓机化。过程中，血管内皮细胞长入并被覆于血栓内裂隙表面，形成新的血管，相互吻合成新的管腔，血流部分恢复，这一过程称为再通。

0 引言 Introduction

深静脉血栓是一类具有较高发生率和病死率的血管性疾病。快速的血栓清除以及管腔血流恢复以减少静脉瓣膜的损害和持续的静脉高压，对降低血栓后综合征的发病率至关重要[1-2]。因此，探讨一种在深静脉血栓形成后，加速其机化及溶解再通，同时能规避早期溶栓出血等不良反应的治疗方法是亟需解决的问题。血栓机化、溶解及再通过程中，3个关键的因素共同发挥作用[3-4]：炎性细胞浸润、纤维蛋白溶解及新血管生成。关于炎性细胞浸润，目前已有较多研究证实[5-6]，而促纤维蛋白溶解的溶栓治疗方法，存在严重出血不良反应如近期脑出血及胃肠活动性溃疡等用药禁忌。该研究旨在关注上述第3点：促进新血管生成，其对血栓消退的重要性已得到广泛认可[7-9]。

脐带间充质干细胞具有归巢至缺血、损伤部位，并在局部建立促血管生成微环境，促进血管新生的特性[10-12]。研究发现其移植后能显著提高损伤部位微血管数量，增加局部血流灌注，而加快伤口愈合或促进器官功能恢复[13-14]，并已用于如脑脊髓损伤[15-17]、下肢缺血[18]、皮肤溃疡等动物模型的移植治疗[19]，但将其用于深静脉血栓的研究尚未见相关报道。

实验结合人脐带间充质干细胞的促血管新生特性，从增加血栓内小血管数量的目标入手，探讨人脐带间充质干细胞移植治疗深静脉血栓的效果，为干细胞移植治疗血栓提供一定的理论基础和前期研究依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2018年3月至11月在南通大学附属医院妇产科实验室及南通大学医学院动物实验中心完成。

1.3 材料 SPF级雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，购自南通大学动物实验中心，许可证编号：SCXK(苏)2004-0001。实验方案经南通大学动物实验伦理委员会批准，批准号为-001，批准时间2018-04-01。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的培养及鉴定 参考课题组前期实验方法[20]，如下：

人脐带间充质干细胞培养细胞来源： 人脐带间充质干细胞来源于南通大学附属医院妇产科提取方法： 取健康足月剖宫产脐带，取材过程注意无菌，剔除1条脐静脉、2条脐动脉，剥离华通氏胶，并剪成1 mm×1 mm×1 mm块状。接种于含12 mL培养基细胞培养基： 培养基：50 mL培养基=45 mL的DMEM-F12(Hyclone公司)+5 mL胎牛血清(ExCell Biology，Inc.)+300 μL青霉素-链霉素溶液(碧云天公司)的T75CM透气培养瓶中细胞传代： 初3 d尽量减少移动和震荡，以利其贴壁，随后根据细胞生长情况换液和传代，期间部分P1代细胞冻存细胞鉴定： 倒置显微镜观察细胞形态

1.4.2 构建下腔静脉血栓模型大鼠 实验大鼠术前12 h禁食水，按体积分数10%水合氯醛3.5 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。待麻醉平稳后，术区备皮、消毒，腹部正中做1个3 cm竖切口，逐层开腹，参考中国学者已发表的相关静脉血栓模型建立的手术经验和技巧[21]，暴露和分离肾静脉以下至髂静脉以上平面的下腔静脉及其属支，见图1。用5-0不可吸收缝线(宁波市成和显微器械厂)结扎此段下腔静脉的属支，之后取左肾静脉以下约2 mm处作为下腔静脉结扎点，钝性分离该处黏膜，于该结扎点的下腔静脉下方横行穿过5-0不可吸收缝线，另取1根4-0缝线(宁波市成和显微器械厂)与下腔静脉主干并行，在5-0缝线打结后抽出与下腔静脉并行的4-0缝线。待见结扎远端局部充血，血管颜色变暗，即认为建模成功，再逐层关腹。切口涂抹红霉素软膏，术后自由食水。

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